Формирование активных центров в молекуле фермента происходит на уровне третичной и четвертичной (если она есть) структуры белка. В каталитическом активном центре происходит химическое превращение субстрата в продукт реакции.
Функциональные группы аминокислот активного центра взаимодействуют с молекулой субстрата, изменяя его электронную структуру, «разрыхляя» химическую связь и способствуя ее разрыву под воздействием реагента. В состав активного центра часто входят аминокислоты гистидин, цистеин, серин, лизин, глутаминовая кислота.